Редактирование генома и будущее

Введение
С момента открытия ДНК было разработано несколько технологий генетического манипулирования организмами для лучшего сельскохозяйственного и промышленного применения. Методы секвенирования нового поколения упростили идентификацию различных генов и мутаций в ДНК. ГМО и методы клонирования, которые используются уже долгое время, являются прямым результатом достижений в этой области. Эти методы клонирования использовались для широкого спектра медицинских, сельскохозяйственных, промышленных и исследовательских целей в течение последних нескольких десятилетий. Однако, несмотря на все разработки и прогресс, существует постоянная потребность в более совершенных и точных методах редактирования генов. Использование программируемых нуклеаз для генетических модификаций возросло за последнее десятилетие из-за их потенциала в лечении различных наследственных заболеваний и рака. За последнее десятилетие были выявлены три основных класса программируемых нуклеаз: нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками (CRISPR), связанные с Cas9 (CRISPR/Cas9). .

Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN)
ZFN были самым ранним разработанным инструментом редактирования генома с большей точностью из-за их способности изменять генетическое содержимое. ZFN состоят из двух доменов, повторяющихся белков цинковых пальцев (ZFP), чьи ДНК-связывающие домены слиты с неспецифическим доменом расщепления ДНК эндонуклеазы рестрикции FokI. ZFN функционируют как димер, где каждая мономерная единица способна распознавать от девяти до 18 пар оснований (п.н.) ДНК через ДНК-связывающий домен с цинковым пальцем. Существует широкий спектр доменов цинковых пальцев, которые распознают отдельные триплеты ДНК. Их можно соединить вместе для создания полидактильных белков с цинковыми пальцами, которые могут воздействовать на широкий спектр возможных последовательностей ДНК. Однако нецелевое редактирование/мутации являются основной проблемой, связанной с редактированием генов на основе ZFN. Таким образом, имеются широкие возможности для повышения эффективности этого процесса.

Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN)
TALEN стали альтернативой ZFN для редактирования генома. Подобно ZFN, TALEN состоят из двух программируемых ДНК-связывающих доменов, слитых с эндонуклеазным доменом FokI, и работают за счет введения двухцепочечных разрывов (DSB). Эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), естественным образом секретируются видами Xanthomonas. бактерий, который связывается с ДНК организма-хозяина. ДНК-связывающий домен TALE представляет собой несколько повторов, содержащих 33-35 аминокислот, каждый из которых распознает один нуклеотид. Специфичность ДНК-связывающего домена TALE обусловлена ​​наличием гипервариабельных областей, присутствующих в каждом домене в положениях 12 и 13 аминокислот. Следовательно, TALEN, специфичные для последовательности, могут быть созданы путем модификации этих аминокислотных остатков в гипервариабельных областях и связывания различных повторов TALE вместе.

Кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами (CRISPR), связанные с Cas9 (CRISPR/Cas9)
Помимо ZFN и TALEN, CRISPR/Cas9 — еще один быстро развивающийся инструмент редактирования генов. Это естественная бактериальная система, которая действует как компонент бактериального адаптивного иммунитета. Он обеспечивает защиту бактерий от вторжения вирусов и плазмид посредством расщепления ДНК под контролем РНК белком Cas. Существует три основных компонента системы CRISPR/Cas9: РНК CRISPR (crRNA), трансактивирующая crRNA (tracrRNA) и фермент Cas9. crRNA транскрибируется из вторгающейся системы и известна как протоспейсерная последовательность и гибридизуется с tracrRNA, которая запускает и действует как основа для связывания нуклеазы Cas9 с участком расщепления ДНК. В отличие от систем ZFN и TALENs, которые распознают конкретные последовательности в заданной последовательности генома с помощью разных белков распознавания, система CRISPR/Cas использует последовательность РНК, комплементарную целевой геномной последовательности. Преимущество гибридизации РНК в сайт-специфическом расщеплении приводит к использованию химерной «направляющей» РНК (гРНК) для геномного редактирования, которая создается путем слияния crРНК и tracrRNA. ГРНК содержит 20 нуклеотидных направляющих последовательностей, предназначенных для связывания со специфическими последовательностями ДНК. Следовательно, гРНК и Cas9 способны сканировать соответствующий сайт и связываться с ним, создавая сайт-специфические двухцепочечные разрывы (DSB). Таким образом, система CRISPR/Cas9 предлагает относительно более точную технику редактирования генов по сравнению с предыдущими методами и может использоваться для широкого спектра приложений.

Заключение
На данный момент очевидно, что нынешние механизмы редактирования генов более точны и имеют широкий спектр применения, не имея при этом больших этических и физиологических последствий. Поэтому большие финансовые преимущества и постоянные улучшения в этой области неизбежны. Кроме того, рациональные исследования и разработки, правильная идентификация целей и защита интеллектуальной собственности имеют большое значение для разработки терапевтических средств, биологических продуктов и процессов следующего поколения.